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核酸分離提取的原則

日期:2025-03-31 09:24
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摘要: 核酸分離提取的原則 核酸包括DNA、RNA兩種分子,在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子,原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子;有些嗜菌體DNA有時為單鏈環(huán)狀分子,RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子,不同類型的RNA分子可以具有不同的結(jié)構(gòu)特點,如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有poly(A)結(jié)構(gòu),至于病毒的DNA、RNA分子,其存在形式多種多樣,有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。 95%的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi),其它5%為細(xì)胞器...

核酸分離提取的原則

核酸包括DNA、RNA兩種分子,在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子,原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子;有些嗜菌體DNA有時為單鏈環(huán)狀分子,RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子,不同類型的RNA分子可以具有不同的結(jié)構(gòu)特點,如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有poly(A)結(jié)構(gòu),至于病毒的DNA、RNA分子,其存在形式多種多樣,有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。


95%的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi),其它5%為細(xì)胞器DNA,如線粒體、葉綠體等。RNA分子則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,約占75%,另有10%在細(xì)胞核內(nèi),15%在細(xì)胞器中,RNA以rRNA的數(shù)量*多(80%-85%),tRNA及核內(nèi)小分子RNA占10%-15%,而mRNA分子大小不一,序列各異。總的來說,DNA分子的總長度一般隨著生物的進(jìn)化程度而增大,而RNA的分子量與生物進(jìn)化無明顯關(guān)系。


分離純化核酸總的原則:1.應(yīng)保證核酸**結(jié)構(gòu)的完整性;2.排除其它分子的污染。

為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究,完整的**結(jié)構(gòu)是*基本的要求,因為遺傳信息全部貯存在**結(jié)構(gòu)之中,核酸的**結(jié)構(gòu)還決定其**結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式。對于核酸的純化應(yīng)達(dá)到


以下三點要求:

1.核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子;

2.其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到*低程度;

3.排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子時應(yīng)去除RNA,反之亦然。


為了保證分離核酸的完整性和純度,在實驗過程中,應(yīng)注意以下事項:

1.盡量簡化操作步驟,縮短提取過程,以減少各種有害因素對核酸的破壞;

2.減少化學(xué)因素對核酸的降解,為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞,操作多在pH4-10的條件下進(jìn)行;

3.減少物理因素對核酸的降解,物理降解因素主要是機(jī)械剪切力,其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌,使溶液快速地通過狹長的孔道,細(xì)胞突然置于低滲液中,細(xì)胞爆炸式破裂以及DNA樣本的反復(fù)凍貯。這些操作細(xì)節(jié)在實驗操作中應(yīng)倍加注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子,如真核細(xì)胞的染色體DNA。對分子量小的環(huán)狀DNA分子,如質(zhì)粒DNA及RNA分子,威脅相對小些。高溫如長時間煮沸,除水沸騰帶來的剪切力外,高溫本身對核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過程中,一般在低溫操作,但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在室溫快速提取與低溫提取,獲得核酸的質(zhì)量沒有太大差異。

4.防止核酸的生物降解,細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵,直接破壞核酸的**結(jié)構(gòu),其中DNA酶,需要金屬二價離子Mg2 、Ca2 的激活,使用EDTA、檸檬酸鹽螯合金屬二價離子,基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布廣泛,極易污染樣品,而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活,所以是生物降解RNA提取過程的主要危害因素。


核酸提取的主要步驟,無外乎破碎細(xì)胞,去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子,去除其它不需要的核酸分子,沉淀核酸,去除鹽類,有機(jī)溶劑等雜質(zhì),純化核酸等。核酸提取的方案,應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點而定,對于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子,事先提取該細(xì)胞器,然后提取目的核酸分子的方案,可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。

滬公網(wǎng)安備 31011702004399號

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